4. DETERMINACION ANALITICA DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

Una vez obtenida la absorbancia por minuto, se puede calcular la actividad enzimática de diferentes formas:
- mediante la aplicación de una variante de la ley de Lambert-Beer
- mediante la construcción de un recta de calibrado
- con medidas indirectas de la concentración de sustrato

Por ser las más empleadas de rutina y porque el último método es la determinación de la concentración de un parámetro, abordado ya en este material, se hablará de los dos primeros. Para ello, se describirán dos ejemplos prácticos de enzimas concretas. Se emplea la siguiente fórmula:

AE (UI / L) = ΔDO / minuto X 1000 / ε x b X VF / VI

Donde los términos son:

- AE (UI / L) : actividad enzimática en unidades internacionales por litro
- ε: coeficiente de extinción molar de la absorbancia que absorbe a la λ del análisis
- b: trayectoria óptica = 1 cm
- VF: volumen final de la cubeta
- VI :volumen de muestra utilizada en el ensayo

La relación de volúmenes corrige el efecto de la dilución de la muestra por reactivos. Como todas las magnitudes son conocidas a excepción de la variación de absorbancia, se queda reducida esta expresión a:

AE (UI / L) = ΔDO / minuto X Factor de cálculo

3. DETERMINACION ANALITICA DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

3.1 ASPECTOS GENERALES
En general, no se determina la concentración de enzimas en tejidos y/o fluidos orgánicos, sino su actividad. El motivo es que la concentración de enzimas en suero es baja; sin embargo, dada su elevada capacidad catalítica es posible determinar su actividad con fiabilidad y se presupone que, por lo general, la actividad es proporcional a la concentración.
Por tanto, es sumamente importante el procesado adecuado de las muestras, para que se garantice la conservación de la estructura proteica, fácilmente alterable por variaciones de:
temperatura, pH muy ácidos o alcalinos, detergentes, metales pesados o la presencia de microorganismos en el recipiente, lo cual degradaría la proteína.
La conservación de los sueros a Tª ambiente genera la inactivación de las enzimas; aunque, en algunos casos, la reducción de esta actividad es reversible (por ejemplo, la actividad de la CK se recupera añadiendo glutation a la reacción); pero, en la mayoría de los casos, el tratamiento inadecuado de la muestra supone la pérdida de, al menos, parte de la actividad enzimática.

Una de las funciones más importantes del técnico de laboratorio es mantener las condiciones más adecuadas para las muestras a procesar.
Para determinar la actividad de las enzimas es necesario conocer:
- la estequiometría de la reacción que cataliza
- si necesita o no cofactor y cuál es
- la concentración mínima de sustrato y cofactor para alcanzar la máxima velocidad
- las condiciones óptimas de medida: pH; tiempo de incubación; procesado de la muestra biológica y los reactivos; Tª; posibles activadores o inhibidores endógenos o exógenos de la muestra
- las características de la técnica analítica para esa muestra biológica
Se puede determinar la actividad enzimática concreta analizando la reacción desde diversos puntos de vista:
- aparición de algún producto
- desaparición del sustrato
- variación del cofactor o de algún componente en el transcurso de la reacción
3.2 TECNICAS DE ANÁLISIS
La técnica analítica específica más empleada es la espectrofotometría ultravioleta – visible (UV-V). En la fase de retardo, inmediatamente después de mezclar los reactivos con la muestra biológica no se debe medir la absorbancia, ya que es una fase de encuentro y acoplamiento de sustrato y enzima. Puede durar de unos segundos a varios minutos. En los productos comerciales nos indican el tiempo que dura este período de retardo.
Al finalizar esta fase, comienza la fase lineal, donde la velocidad de formación del producto permanece constante y es en esta etapa donde se determina la actividad enzimática.
A medida que va transcurriendo la reacción, llega un momento en que la velocidad comienza a disminuir, debido a factores como el agotamiento de sustrato, el equilibrio entre sustrato y producto y / o variaciones de pH que no han podido ser amortiguadas por el tampón, a efectos de inhibición del enzima, etc.…
La actividad enzimática se mide en Unidades Internacionales por unidad de volumen (UI / mL, U / L…). Se define como la cantidad de enzima que transforma un micromol de sustrato en un minuto en condiciones estándar previamente establecidas. En cada técnica analítica se define la unidad de actividad y sus unidades.

3.3 MÉTODOS ANALÍTICOS DE DETERMINACIÓN ENZIMÁTICA
En estos métodos, no es importante un dato puntual de absorbancia sino la variación de la absorbancia por unidad de tiempo ocasionada por la actividad de la enzima que se pretende analizar su actividad.
A grandes rasgos, hablamos de dos métodos de análisis:
- métodos a punto final: se mide la absorbancia tras un tiempo determinado, en el cual se estima ha tenido lugar la reacción
- método cinético: consisten en medir la absorbancia varias veces, con intervalos de minutos; permiten comprobar que se encuentra en la zona lineal de la curva, ideal para la determinación; si se detectan desvíos de la linealidad, de desprecian alguna de las medidas finales de absorbancia.
En los productos comerciales, se indican los pasos a seguir en cada determinación para que el resultado sea fiable.
Muchos métodos de determinación se basan en la medida de absorbancia de cofactores, que median en la reacción: complejos NAD-NADH; o NADP-NADPH.

2. TIPOS Y CLASES DE ENZIMAS

2.1. ENZIMAS PLASMÁTICAS
En el suero de individuos sanos se detectan actividades enzimáticas fisiológicas que tienen distintos orígenes:
• Enzimas plasma específicas: que desarrollan su propia función en el plasma. Por ejemplo: enzimas de la coagulación como la protrombina, etc.
• Actividades enzimáticas fisiológicas que mantienen niveles constantes y bajos. Tienen su origen en la constante renovación celular de los tejidos, en la actividad muscular y en el paso de enzimas de órganos secretores al torrente circulatorio. Cuando existe alguna lesión en la membrana celular, el contenido citoplasmático de la célula y con él los enzimas intracelulares, son vertidos al exterior. Cuando los enzimas llegan al torrente circulatorio existen sistemas encargados de captarlos, metabolizarlos y eliminarlos, por lo tanto, las enzimas permanecen en sangre un tiempo determinado.

2.2 CLASES DE ENZIMAS
Existen 6 clases posibles de enzimas, con respecto a la reacción que catalizan son:
• Clase I Oxido-reductasas: catalizan reacciones de oxido reducción. Por ejemplo:
deshidrogenasas, oxidasas, reductasas, etc. A + B A reducido + B reducido
• Clase II Transferasas: catalizan reacciones de transferencia de grupos funcionales, partes de moléculas, etc., de un donador a un aceptor. Por ejemplo: las transaminasas
A-B + C A + B-C
• Clase III Hidrolasas: catalizan reacciones de hidrólisis de enlaces al añadir una molécula de agua. Por ejemplo: lipasas, amilasas, peptidasas, etc.
A-B + H20 A-H + B-OH
• Clase IV Liasas: catalizan reacciones de eliminación o adición de alguna molécula, grupo funcional, etc. Por ejemplo la descarboxilasa
A-CO2  A + CO2
• Clase V Isomerasas: catalizan reacciones de isomerización. Por ejemplo: las epimerasas y mutarotasas.
A  A*
• Clase VI Ligasas: catalizan reacciones de condensación de dos moléculas por formación de un enlace a costa de la hidrólisis de un trifosfato. Por ejemplo las sintetasas
A + B + NTP  A-B + NDP + P
2.3 ENZIMAS ANALIZADAS EN DIAGNOSTICO CLINICO
2.3.1. Fosfatasas
Pertenecen a la Clase III y subclase Esterasas. Se incluyen principalmente:
• Fosfatasa Alcalina (EC 3.1.3.1): es una enzima intracelular que se encuentra prácticamente en todos los tejidos (si hay lesión del tejido aumenta en el plasma).Es un marcador muy sensible de la enfermedad obstructiva hepática, pero no es específica porque también aumenta en enfermedades óseas y en situaciones fisiológicas como el embarazo y en el crecimiento. Tiene un pH óptimo de 9.
• Fosfatasa Ácida (EC 3.1.3.2): está en numerosos tejidos, pero el más rico en fosfatasa ácida es la próstata. Tiene varias isoenzimas pero sólo son útiles la “isoenzima 2 o prostática” que se determina por electroforesis, y las “isoenzimas 1 y 5” del bazo humano en la enfermedad de Gaucher.
La isoenzima que más frecuentemente se estudia en el laboratorio es la 2, que se utiliza como marcador tumoral en los calcinomas metaestáticos de próstata. En condiciones no patológicas la tasa de fosfatasa ácida prostática es igual en hombres y en mujeres.

2.3.2. Cretina Quinasa CK (EC 2.7.3.2): es una transferasa que cataliza la formación de ATP requerido por los sistemas contráctiles o de transporte. Es una enzima citoplasmática y mitocondrial ampliamente distribuida por los tejidos, pero en forma decreciente, sobre todo se localiza en músculo esquelético, músculo cardíaco, placenta, cerebro y otros tejidos.
Está formada por dos subunidades, la M y la B. Estas a su vez se combinan formando tres isoenzimas que son: CK-MM; CK-BB; CK-MB. Se pueden identificar por distintos métodos, fundamentalmente por electroforesis, cromatografía de intercambio iónico, inhibición, aglutinación y RIA.
La CK-MM predomina en el músculo esquelético, en el miocardio también predomina la CK-MM pero hay entre un 13-22% de CK-MB. En el cerebro hay un 100% de CK-BB.

2.3.3. Aminotransferasas o Transaminasas:
• AST (EC 2.6.1.1): Aspartato Aminotrasferasa (GOT glutámico oxalacética). Existen dos formas de AST, la mitocondrial que es la más abundante y la citoplasmática que se encuentra en menor cantidad y es soluble. La AST se localiza en el corazón, en el hígado, músculo esquelético y riñón. Su aumento en el suero indica daño tisular pero no de órgano específico.
• ALT (EC 2.6.1.2): Alanina Aminotransferasa (GPT Transaminasa Glutámico Pirúvica). Se distribuye principalmente en el hígado y, en menor proporción en miocardio y otros tejidos. No es específica de enfermedad hepática.
• GGT (EC 2.3.2.2): Gamma Glutamil Transferasa. Se distribuye por riñón, páncreas, hígado y próstata. Se utiliza en el estudio de enfermedades de origen alcohólico debido a que es una enzima microsómica y el alcohol es capaz de provocar un aumento de este enzima.

2.3.4. Lactato Deshidrogenasa LDH (EC 1.1.1.27): está ampliamente distribuida por todos los tejidos pero es más abundantes en corazón, músculo esquelético, riñón e hígado. Está constituida por cuatro subunidades, que pueden ser de dos tipos: subunidad H, específica del corazón y subunidad M del músculo. Estas subunidades se combinan de 5 formas diferentes dando lugar a 5 isoenzimas: LDH 1(4H), LDH 2 (3H/1M), LDH 3 (2H/2M), LDH 4 (3h/1H) y LDH 5 (4M).
La LDH existente en el miocardio contiene más isoenzimas LDH 1 y LDH 2, y en el hígado y músculo esquelético mayor proporción de LDH 4 y LDH 5.

2.3.5. -Amilasa (EC 3.2.1.1): transforma los hidratos de carbono en componentes más sencillos. En condiciones normales se produce en las glándulas salivares y en el páncreas exocrino. Tiene un bajo peso molecular por lo que se filtra fácilmente por los glomérulos renales, aumentando en orina cuando está aumentada en suero. Tiene dos isoenzimas:
- Amilasa P: producida en el páncreas
- Amilasa S: producida en las glándulas salivares
Las isoenzimas se pueden separar por electroforesis y se usa sobre todo para el estudio de pancreatitis.

1. FISIOLOGIA Y CINETICA ENZIMATICA

1.1. DEFINICION Y COMPOSICION DE ENZIMAS
Las enzimas y biocatalizadores son proteínas biológicas especializadas en la catálisis de reacciones orgánicas (catálisis: acción físico química por la cual ciertos cuerpos, llamados catalizadores determinan modificaciones en el medio en el que se encuentran, sin ser ellos mismos químicamente modificados; catalizador: sustancias que producen catálisis, es decir, que acelera o retraso un proceso químico sin ser consumidos durante la reacción).
En la determinación de su actividad es sumamente importante el procesado adecuado de las muestras que garantice la conservación de la estructura proteica, fácilmente alterable, por variaciones de temperatura, pH muy ácidos o muy alcalinos, detergentes, microorganismos de los recipientes, etc.
La conservación de los sueros durante varios días a temperatura ambiente provoca la in activación de la mayoría de las enzimas. En algunos casos, la reducción de esta actividad es reversible (inactivación reversible) pero la mayor parte de los casos de las veces el tratamiento adecuado de al muestra supone la pérdida irreversible de su actividad.

Composición: las enzimas pueden contener otras fracciones que no tengan carácter proteico. Estos componentes tienen un paso molecular menor (<1.000) que las enzimas (peso molecular 10 kDa-2.000 KDa) y se denomina cofactores.
Estos se pueden diferenciar entre:
- Iones metálicos: han de encontrarse en un determinado estado de oxidación y no se modifican durante la catálisis. Su función puede ser la de ayudar a captar el sustrato en su centro activo, mantener la estructura espacial de la enzima ó tener un papel activo al realizar la función catalítica. Se les conocen como ‘activadores enzimáticos’
- Moléculas orgánicas: si después de la reacción permanecen enérgicamente unidas a la enzima se denominan grupo protéticos (ejemplo: piridoxal fosfato, que participa en al reacción de transaminación de la GOT y GPT, estando sobre todo unida a la GPT). Si se unen al enzima sólo durante la reacción catalítica se denominan coenzimas (ejemplo: ADP y ATP que participan en las reacciones de quinasas).
A las enzimas que precisa del cofactor se denominan holoenzimas y están formadas por el apoenzima (es la estructura proteica) y el cofactor (que es la estructura no proteica).
1.2. MECANISMO DE ACCIÓN ENZIMÁTICA
Las reacciones quimicas tienen lugar porque los reactivos llegados un momento pueden llegar a acumular la energía suficiente como para poder llegar a un estado denominado estado de transición, estado activado y altamente energético e inestable.
En este estado de elevado energía es muy probable que se rompan algunos enlaces entre ambos y otros se formen, para dar lugar a los productos de la reacción. La energía que alcanzan se denomina energía de activación. Las enzimas se unen con los reactivos de manera de activación. Las enzimas se unen con los reactivos de manera transitoria y alcanzar un estado de transición de menor energía y por tanto de menor estabilidad que corresponde a la reacción no catalizada. La función de los biocatalizadores orgánicos, las enzimas, es la de acelerar la velocidad de las reacciones, al disminuir la energía de activación y la obtención por rápida de los productos (Esquema 1).

Esquema 1: Gráficos de Energía libre en la catálisis enzimática

Reacción enzimática

1.3. FENÓMENO CATALÍTICO
Las enzimas tienen en su estructura un lugar concreto a través del cual realizan su función, denominado centro activo (CA). El resto de la estructura tiene la función de proporcionar un entorno y condiciones propicias para que la enzima actúe.
La enzima se une al sustrato por el centro activo y el enlace puede ser de diferentes formas: puentes de H2, interacciones electrostáticas, fuerzas de Van der Waals, etc.
Se han desarrollado varias hipótesis con respecto a la conformación que se da en este centro activo entre la enzima y el sustrato:
- hipótesis de llave-cerradura: se considera cierta rigidez en la estructura del CA de la enzima; el sustrato se acopla al CA porque su estructura es complementaria
- hipótesis del acoplamiento inducido: la estructura espacial del CA no es rígida y al unirse al sustrato, éste induce un cambio en la estructura de la enzima para que puedan acoplarse

Otra característica de cada enzima es su especificidad por el sustrato, que puede ser:
- de reacción: cataliza el mismo tipo de reacción, pero con diferentes sustratos, que presentan alguna característica común; lipasas
- absoluta: cuando sólo actúa con un sustrato; por ejemplo, la LDH
- estéreo-específica: sólo actúan sobre sustratos con configuraciones espaciales particulares; por ejemplo, la L-amidohidrolasa

Por este motivo, hay muchos factores que influyen en la actividad enzimática, tal como: la concentración del sustrato, pH, temperatura y presencia de inhibidores o activadores.

Por último, daremos algunas indicaciones acerca de la nomenclatura internacional de enzimas. Esta nomenclatura la impone la Internacional Union of Biochemistry, que recomendó en 1964 una nomenclatura basada en la reacción que catalizan. En 1973, apareció una versión ampliada donde el nombre científico describe el tipo de reacción, el sustrato, la coenzima y el producto, axial por ejemplo la LDH, recibe el nombre de L-Lactato:piruvato NAD deshidrogenasa.
Además a cada enzima se le da un numero que deriva de la nomenclatura, encabezado por las siglas EC (Enzyme Commission), así la LDH es la EC 1.1.1.3
Para una descripción mas exacto es necesario indicar la procedencia de la enzima, especie, tejido, localización en el interior o exterior de la célula.

1.4. FORMAS EN LAS QUE PUEDE APARECER LAS ENZIMAS
1.4.1. Isoenzimas o Isozimas
Son formas múltiples de una determinada enzima y catalizan la misma reacción. Estas proteínas se diferencian en sus propiedades fisicoquímicas: tamaño, estructura, peso molecular, solubilidad, comportamiento catalítico, etc.
Por ejemplo: la LDH (lactato deshidrogenasa) aparece en 5 isoformas que catalizan la reacción reversible. Lactato x piruvato. Consta de un tetrámero formado por cadenas de dos tipos: H (heart) y M (muscle). Sus formas isoenzimáticas son: LD-5:M4; LD-4:M3H1; LD-3:M2H2; LD-2:MH3; LD-1:H4.
Otra enzima bastante común en analítica es la creatin quinasa (CK), dímero formado por dos subunidades, B (brain) y M (muscle). Presenta tres formas: CK-BB (en cerebro); CK-MB (en miocardio); CK-MM (músculo esquelético y cardíaco).

1.4.2. Complejos multienzimáticos
Son asociaciones de enzimas que catalizan reacciones consecutivas. El producto de una reacción es el sustrato de la siguiente:
A  B  C D.
Si las enzimas no forman el complejo, se perderá más sustrato, pero al constituirlo, se establece un microentorno de las enzimas con los reactivos y se optimiza la reacción, ya que el producto se libera en las inmediaciones del centro activo de la enzima siguiente.
Un ejemplo: la piruvato deshidrogenasa (PDH) cataliza la reacción Piruvato Acetil-CoA

1.4.2. Proenzimas
Formas precursoras inactivas de las enzimas. A este grupo pertenecen las enzimas proteolíticas propias de la digestión. Solo alcanzan su forma activa en el momento y lugar determinado, cuando debe realizar su función catalítica. El paso de proenzima a enzima activa supone una rotura de un enlace peptídico concreto.