3. DETERMINACION ANALITICA DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

3.1 ASPECTOS GENERALES
En general, no se determina la concentración de enzimas en tejidos y/o fluidos orgánicos, sino su actividad. El motivo es que la concentración de enzimas en suero es baja; sin embargo, dada su elevada capacidad catalítica es posible determinar su actividad con fiabilidad y se presupone que, por lo general, la actividad es proporcional a la concentración.
Por tanto, es sumamente importante el procesado adecuado de las muestras, para que se garantice la conservación de la estructura proteica, fácilmente alterable por variaciones de:
temperatura, pH muy ácidos o alcalinos, detergentes, metales pesados o la presencia de microorganismos en el recipiente, lo cual degradaría la proteína.
La conservación de los sueros a Tª ambiente genera la inactivación de las enzimas; aunque, en algunos casos, la reducción de esta actividad es reversible (por ejemplo, la actividad de la CK se recupera añadiendo glutation a la reacción); pero, en la mayoría de los casos, el tratamiento inadecuado de la muestra supone la pérdida de, al menos, parte de la actividad enzimática.

Una de las funciones más importantes del técnico de laboratorio es mantener las condiciones más adecuadas para las muestras a procesar.
Para determinar la actividad de las enzimas es necesario conocer:
- la estequiometría de la reacción que cataliza
- si necesita o no cofactor y cuál es
- la concentración mínima de sustrato y cofactor para alcanzar la máxima velocidad
- las condiciones óptimas de medida: pH; tiempo de incubación; procesado de la muestra biológica y los reactivos; Tª; posibles activadores o inhibidores endógenos o exógenos de la muestra
- las características de la técnica analítica para esa muestra biológica
Se puede determinar la actividad enzimática concreta analizando la reacción desde diversos puntos de vista:
- aparición de algún producto
- desaparición del sustrato
- variación del cofactor o de algún componente en el transcurso de la reacción
3.2 TECNICAS DE ANÁLISIS
La técnica analítica específica más empleada es la espectrofotometría ultravioleta – visible (UV-V). En la fase de retardo, inmediatamente después de mezclar los reactivos con la muestra biológica no se debe medir la absorbancia, ya que es una fase de encuentro y acoplamiento de sustrato y enzima. Puede durar de unos segundos a varios minutos. En los productos comerciales nos indican el tiempo que dura este período de retardo.
Al finalizar esta fase, comienza la fase lineal, donde la velocidad de formación del producto permanece constante y es en esta etapa donde se determina la actividad enzimática.
A medida que va transcurriendo la reacción, llega un momento en que la velocidad comienza a disminuir, debido a factores como el agotamiento de sustrato, el equilibrio entre sustrato y producto y / o variaciones de pH que no han podido ser amortiguadas por el tampón, a efectos de inhibición del enzima, etc.…
La actividad enzimática se mide en Unidades Internacionales por unidad de volumen (UI / mL, U / L…). Se define como la cantidad de enzima que transforma un micromol de sustrato en un minuto en condiciones estándar previamente establecidas. En cada técnica analítica se define la unidad de actividad y sus unidades.

3.3 MÉTODOS ANALÍTICOS DE DETERMINACIÓN ENZIMÁTICA
En estos métodos, no es importante un dato puntual de absorbancia sino la variación de la absorbancia por unidad de tiempo ocasionada por la actividad de la enzima que se pretende analizar su actividad.
A grandes rasgos, hablamos de dos métodos de análisis:
- métodos a punto final: se mide la absorbancia tras un tiempo determinado, en el cual se estima ha tenido lugar la reacción
- método cinético: consisten en medir la absorbancia varias veces, con intervalos de minutos; permiten comprobar que se encuentra en la zona lineal de la curva, ideal para la determinación; si se detectan desvíos de la linealidad, de desprecian alguna de las medidas finales de absorbancia.
En los productos comerciales, se indican los pasos a seguir en cada determinación para que el resultado sea fiable.
Muchos métodos de determinación se basan en la medida de absorbancia de cofactores, que median en la reacción: complejos NAD-NADH; o NADP-NADPH.